วิธีการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์สำหรับการศึกษาในหลอดทดลอง

(Cytotoxicity Assay for In Vitro Study)

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์หรือการมีชีวิตรอดของเซลล์ (Cytotoxicity Test and Cell viability assay) นั้น สามารถใช้ประเมินความปลอดภัยของตัวอย่างต่อเซลล์ที่มีชีวิตในระดับห้องปฏิบัติการ ซึ่งเซลล์ที่ใช้ทดสอบนั้นเปรียบเสมือนเป็นตัวแทนของร่างกายของมนุษย์และสัตว์ ทั้งนี้การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์สามารถใช้เป็นข้อมูลในการศึกษาผลการตอบสนองของเซลล์เพาะเลี้ยงต่อสารทดสอบ จึงถือได้ว่าการทดสอบความเป็นพิษนั้นเป็นวิธีที่มีประโยชน์อย่างมากในวงการด้านการวิจัยและการแพทย์ในปัจจุบัน ตัวอย่างที่ใช้ในการทดสอบสามารถทดสอบได้กับสารสกัดจากพืช สมุนไพร หรือผลิตภัณฑ์ยา การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ถือเป็นวิธีการทดสอบที่ไม่อันตรายต่อสิ่งมีชีวิต และใช้ระยะเวลาการทดสอบไม่นาน การเลือกใช้วิธีการตรวจสอบความเป็นพิษของเซลล์ได้อย่างเหมาะสมและสอดคล้องกับวัตถุประสงค์การศึกษาวิจัย จึงเป็นปัจจัยสำคัญที่มีผลต่อการประเมินฤทธิ์ของตัวอย่างทดสอบทั้งในเชิงปริมาณและคุณภาพ ในปัจจุบันมีวิธีการตรวจวิเคราะห์หลายประเภทที่สามารถใช้เพื่อกำหนดจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตได้แก่ การนับจำนวนเซลล์ กรวัดกิจกรรมเมตบอลิซึมของเซลล์ และกรตรวจสอบปริมาณ adenosine triphosphate ATP ภายในเซลล์ 

1. การนับจำนวนเซลล์ด้วยวิธีการย้อมสีเซลล์ (dye exclusion assays) 

เป็นวิธีพื้นฐานสำหรับตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์แบบทางตรง การนับจำนวนเซลล์ทำได้ด้วยการย้อมด้วยสี trypan blue โดยหลักการแล้ว trypan blue สามารถแพร่ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่ตายแล้วได้เท่านั้น ทำให้เซลล์ที่ตายแล้วย้อมติดสีน้ำเงิน จึงทำให้แยกความแตกต่างระหว่างเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายได้  และสามารถนับแยกจำนวนเซลล์เซลล์ตายได้ด้วย hemocytometer หรือโดยการใช้เครื่องนับเซลล์อัตโนมัติ (automated cell counter) นอกจากนี้ยังมีการประยุกต์ใช้สีย้อมต่างๆอีกมากมาย เช่น Eosin และ Congo red การย้อมด้วยสี Eosin เป็นสีย้อมสีแดงเรืองแสงที่ใช้ในการย้อมสีของส่วนประกอบต่างๆในเซลล์ ได้แก่ cytoplasm collagen และเส้นใยกล้ามเนื้อ ทำให้สามารถมองเห็นได้ชัดเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ในทำนองเดียวกัน Congo red เป็นสีย้อมที่ใช้ในการย้อมสี cytoplasm เช่นเดียวกัน หลักการของการย้อมสีด้วย Eosin และ Congo red อาศัยความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายเช่นเดียวกับการทดสอบการย้อมสีด้วย trypan blue

รูปที่ 1. Cell viability with trypan blue assay (Kamiloglu, et al. 2020)

1. การวัดกิจกรรมเมตบอลิซึมของเซลล์ (Colorimetric assays)

 เป็นวิธีการตรวจวัดความเป็นพิษและการมีชีวิตรอดของเซลล์ผ่านกลไกทางชีวเคมี โดยเป็นการตรวจวัดปริมาณเอนไซม์ภายในเซลล์ที่ไปกระตุ้นให้มีการเปลี่ยนสีของสาร กล่าวคือเซลล์ที่มีชีวิตพยายามแปลงสารอาหารและโมเลกุลต่างๆ เป็นสารประกอบที่มีพลังงานสูงเพื่อใช้เป็นพลังงานสำหรับกิจกรรมที่จำเป็นของเซลล์ กระบวนการแปลงโมเลกุลให้เป็นแหล่งพลังงานต้องการเอนไซม์หลายชนิด ดังนั้นเอนไซม์ในเซลล์มักใช้ในการตรวจวัดกิจกรรมทางเมตาบอลิซึมของการมีชีวิตของเซลล์ และโมเลกุลที่ได้จากกระบวนการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้คือ Adenosine triphosphate (ATP) ซึ่งเป็นโมเลกุลที่เป็นตัวชี้วัดความมีชีวิตของเซลล์เช่นกัน การวัดกิจกรรมเมตาบอลิซึมของเซลล์เป็นการวัดความมีชีวิตของเซลล์ทางอ้อมที่ได้รับความนิยมอย่างแพร่หลาย สามารถทำได้หลายวิธี เช่น Tetrazolium-based assays, ATP-based cell viability assays และ Resazurin reduction assay 

2.1 การทดสอบด้วยวิธี Tetrazolium-based assays

      เป็นการทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ด้วยสารในกลุ่ม tetrazolium salt ซึ่งถูกรีดิวซ์โดยเซลล์ที่มีชีวิตเพื่อสร้างฟอร์มาซานที่มีสี (colored formazans) การเปลี่ยนแปลงของสีสามารถวัดได้โดยใช้เครื่อง microplate reader แบบดูดกลืนแสง และกิจกรรมทางเมตาบอลิซึมของเซลล์ที่น้อยลงเนื่องจากจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตที่น้อยลงจะรีดิวซ์ tetrazolium salt น้อยลงด้วย การดูดกลืนแสงของฟอร์มาซานจะลดลงเมื่อจำนวนเซลล์ที่น้อยลง สารในกลุ่ม tetrazolium salt ในแต่ละชุดทดสอบจะมีการละลายน้ำและสีของฟอร์มาซานแตกต่างกันไป ซึ่งจำเป็นต้องเลือกใช้ความยาวคลื่นที่มีคความแตกต่างกันไปในการวิเคราะห์ในแต่ละชุดทดสอบดังตารางที่ 1 ตัวอย่างชุดทดสอบในกลุ่ม Tetrazolium-based assays ได้แก่ MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), XTT (sodium 2,3,-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium), MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium) และ WST-1 (sodium 5-(2,4-disulfophenyl)-2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-2H tetrazolium inner salt) assays 

ตารางที่1 Tetrazolium-based cell viability assays

รูปที่ 2. Summary of tetrazolium-based cell viability assays (Batool, et al. 2022) 

1. การทดสอบด้วยวิธี Resazurin reduction assay

    สีย้อม Resazurin เป็นสีอีกชนิดหนึ่งที่ใช้ในการประเมินความมีชีวิตของเซลล์โดยพิจารณาจากกิจกรรมทางเมตาบอลิซึมที่ลดตัวของเซลล์ สีย้อม Resazurin สามารถผ่านเข้าสู่เซลล์ได้โดยไม่เป็นพิษต่อเซลล์ โดยมีหลักการคือเป็นการวัดปริมาณเอนไซม์ mitochondrial reductase ของเซลล์ โดยเมื่อสารละลาย Resazurin เข้าสู่เซลล์ จะถูก reduced ด้วยเอนไซม์ mitochondrial reductase และเปลี่ยนจากสารละลายสีม่วงเป็นสารเรืองแสงสีแดง เรียกว่า resorufin การทดสอบนี้สามารถวัดในโหมดการดูดกลืนแสงโดยการวัดการดูดกลืนที่ 570 นาโนเมตร  

                  รูปที่ 3. Principle of Resazurin reduction assay (Riss, et al. 2013)

2.3 การทดสอบด้วยวิธี ATP Luciferase assay

 เป็นวิธีที่รวดเร็วในการประเมินการมีชีวิตของเซลล์โดยการวัดระดับ ATP ภายในเซลล์ กล่าวคือ ATP ซึ่งเป็นแหล่งพลังงานของเซลล์ มีความสัมพันธ์โดยตรงกับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต เมื่อเซลล์เกิดการแตกออก ATP ที่ปล่อยออกมาจะมีการวัดปริมาณ ATP โดยใช้ปฏิกิริยา luciferin luciferase bioluminescence ที่ทำให้เกิดการเปล่งแสง bioluminescence ออกมา ซึ่งสามารถวัดปริมาณแสงที่เกิดขึ้นด้วยเครื่อง microplate-based luminometer 

รูปที่ 4. Principle of ATP Luciferase assay (Kamiloglu, et al. 2020)

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์หรือการมีชีวิตรอดของเซลล์ โดยการวัดกิจกรรมเมตาบอลิซึมของเซลล์ด้วยวิธี Tetrazolium-based assays เป็นวิธีที่ได้รับความนิยมมากที่สุด เพราะรวดเร็วและเชื่อถือได้ แต่อาจมีข้อจำกัดในด้านประสิทธิภาพของเอนไซม์ในกิจกรรมเมตาบอลิซึมที่ขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่าง เช่น ชนิดของเซลล์ที่ทดสอบ สารที่ทดสอบ และระยะเวลาของการทดสอบ ซึ่งปัจจัยเหล่านี้ส่งผลต่อการมีชีวิตและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ได้ ในทางตรงข้าม การทดสอบด้วยวิธี ATP Luciferase assay เป็นวิธีที่มีความแม่นยำเพราะเป็นการวัดปริมาณ DNA ภายในเซลล์ แต่อาจต้องคำนึงถึงองค์ประกอบของสารที่ทดสอบ เช่น ปริมาณโปรตีนที่อาจรบกวนความจำเพาะเจาะจงของการตรวจปริมาณ DNA ได้ ดังนั้นควรเลือกวิธีการทดสอบให้เหมาะสมกับสภาวะพื้นฐานของเซลล์ สารที่ทดสอบ และวัตถุประสงค์ของการวิจัย การเลือกวิธีการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหมาะสมสำหรับการศึกษาในหลอดทดลอง ควรพิจารณาทดสอบมากกว่าหนึ่งวิธีเพื่อให้ได้ข้อมูลที่มีประสิทธิภาพ น่าเชื่อถือ และแม่นยำที่สุด 

เอกสารอ้างอิง

1. Batool S, et al. 2022. Addressing artifacts of colorimetric anticancer assays for plant-based drug development. Med Oncol 39, 198. 
2. Kamiloglu S, et al. 2020. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1.
3. Riss T.L., et al. 2013. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 

Sirirak Mukem, and Saowanee Maungchanburi, 2023. Selection of Appropriate Methods Analysis of Cytotoxicity Assay for In Vitro Study, PSU Medical Journal 3(2):85-91.

เขียนโดย รศ.สพ.ญ.ดร.อุสุมา เจิมนาค

Cytotoxicity Assay for In Vitro Study

Cytotoxicity tests, also known as cell viability assays, are employed to evaluate the safety of a sample on living cells in a laboratory setting. The cells used in these tests serve as representatives of human and animal bodies. These assays provide valuable data for studying the response of cultured cells to test substances, making them indispensable tools in research and medical fields. Examples of substances tested include plant extracts, herbal remedies, and pharmaceutical products. Cytotoxicity tests offer a non-invasive and relatively quick method for assessing the safety of substances. The appropriate selection of cytotoxicity assay methods, aligned with the research objectives, is crucial for both quantitative and qualitative evaluation of the test substance.

Several methods can be used to determine the number of viable cells: cell counting, measurement of cellular metabolic activity, and quantification of intracellular adenosine triphosphate (ATP).

1. Cell Counting with Dye Exclusion Assays

This is a fundamental method for directly assessing cell viability. Cell counting is performed by staining with trypan blue. The principle is that trypan blue can penetrate the membranes of dead cells but not live ones, causing dead cells to stain blue. This allows for the differentiation between live and dead cells and enables the counting of both using a hemocytometer or an automated cell counter. Other dyes such as Eosin and Congo red can also be used. Eosin stains cytoplasmic components like collagen and muscle fibers, while Congo red stains the cytoplasm. Both Eosin and Congo red rely on the integrity of the cell membrane to distinguish between live and dead cells, similar to trypan blue staining.

Fig. 1. Cell viability with trypan blue assay (Kamiloglu, et al. 2020)

2. Measurement of Cellular Metabolic Activity (Colorimetric Assays)

This method assesses cell viability and survival through biochemical mechanisms. It involves measuring the quantity of intracellular enzymes that induce a color change in a substance. Live cells convert nutrients and molecules into high-energy compounds for cellular activities. This process requires various enzymes. Therefore, intracellular enzymes are often used to measure cellular metabolic activity, and one of the resulting molecules is adenosine triphosphate (ATP), a direct indicator of cell viability. Measurement of cellular metabolic activity is a widely used indirect method for assessing cell viability. There are several methods, including Tetrazolium-based assays, ATP-based cell viability assays, and Resazurin reduction assay.

2.1 Tetrazolium-based assays: These assays involve the use of tetrazolium salts, which are reduced by live cells to form colored formazans. The color change can be measured using a microplate reader, and the reduced metabolic activity of cells due to a lower number of viable cells results in less reduction of tetrazolium salt. Examples of Tetrazolium-based assays include: MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), XTT (sodium 2,3,-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium), MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium) and WST-1 (sodium 5-(2,4-disulfophenyl)-2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-2H tetrazolium inner salt) assays.

Table 1. Tetrazolium-based cell viability assays 

Fig. 2. Summary of tetrazolium-based cell viability assays (Batool, et al. 2022)

2.2 Resazurin reduction assay: Resazurin is another dye used to assess cell viability based on cellular reductive metabolic activity. Resazurin can enter cells without being toxic and is reduced by the mitochondrial reductase enzyme to form a red fluorescent compound called resorufin.

Fig. 3. Principle of Resazurin reduction assay (Riss, et al. 2013)

2.3 ATP Luciferase assay: This is a rapid method for assessing cell viability by measuring intracellular ATP levels. ATP, the energy currency of cells, is directly correlated with the number of viable cells. When cells are disrupted, the released ATP is quantified using the luciferin-luciferase bioluminescence reaction, producing bioluminescence that can be measured using a microplate-based luminometer.

Fig. 4. Principle of ATP Luciferase assay (Kamiloglu, et al. 2020)

In summary, cytotoxicity tests, particularly those based on cellular metabolic activity using Tetrazolium-based assays, are highly popular due to their speed and reliability. However, these methods may have limitations regarding the efficiency of enzymes in metabolic activity, which can be influenced by factors such as the cell type, test substance, and duration of the test. In contrast, ATP Luciferase assays are highly accurate as they measure intracellular DNA but may be affected by the composition of the test substance, such as protein content, which can interfere with DNA quantification. Therefore, the choice of cytotoxicity assay should be tailored to the specific conditions of the cells, test substance, and research objectives. It is recommended to employ multiple assays to obtain the most reliable and accurate data.

Written by Dr. Usuma Jermnark

References

Batool S, et al. 2022. Addressing artifacts of colorimetric anticancer assays for plant-based drug development. Med Oncol 39, 198.

Kamiloglu S, et al. 2020. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1.

Riss T.L., et al. 2013. Cell viability assays. Assay Guidance Manual.

Sirirak Mukem, and Saowanee Maungchanburi, 2023. Selection of Appropriate Methods Analysis of Cytotoxicity Assay for In Vitro Study, PSU Medical Journal 3(2):85-91.